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Forschungsarbeit

Kinetik von DNA-Haarnadelschleifen in zellähnlicher Umgebung

Von Olivia Stiehl (24.06.2014)

Meine Forschungsarbeit beschäftigt sich mit der Kinetik von DNA-Haarnadelschleifen. Der Name dieser besonderen Konformation von Einzelstrang DNA kommt von ihrem ungewöhnlichen Erscheinungsbild: Die Enden des Strangs besitzen komplementäre Basen, sodass sich eine Art Doppelstrang über einige Basenpaare hinweg ausbilden kann. Der verbleibende Strang dazwischen ist gebogen, sodass die DNA aussieht wie eine gewöhnliche Haarnadel.

[Bildunterschrift / Subline]: Schematische Darstellung eines DNA-Einzelstrangs: Aufgrund der komplementären Basenpaare an den Strangenden kann die DNA sowohl als Haarnadelstruktur (im Bild rechts) als auch in der offenen Konformation (links) vorliegen. Die Haarnadelstruktur besteht aus der Schleife und dem Stamm. Um die Übersichtlichkeit zu wahren, sind die Basen in der Schleife nicht einzeln abgebildet, sondern durch einen Strich vereinfacht.

Dieser Haarnadelstruktur gilt ein besonderes Interesse, da sie immer dann auftreten kann, wenn DNA in Form von Einzelsträngen vorliegt. Dies ist zum Beispiel während der Zellteilung der Fall, wenn die Doppelhelix durch Enzyme aufgebrochen wird und an beide Einzelstränge der komplementäre Strang synthetisiert wird. Für den Fall, dass sich der Einzelstrang jedoch zu einer Haarnadel formt, wird dieser Prozess gestoppt bis die Haarnadel sich wieder öffnet. Um etwas über die Geschwindigkeit bzw. Störungen während der Zellteilung aussagen zu können, ist es also wichtig die Kinetik dieser Haarnadeln zu verstehen.

Eine mögliche pharmazeutische Anwendung der DNA-Haarnadeln ist die sogenannte antisense therapy. Bei einigen Krankheiten wie beispielsweise bestimmten Krebsarten ist bereits bekannt welcher Abschnitt unserer Erbinformation verändert ist. Da man verhindern möchte, dass sich kranke Zellen weiterhin teilen, versucht man eine zur Krankheit komplementäre Erbinformation im Labor zu synthetisieren und diese zu injizieren. Ziel dieser Therapie ist es, dass die artifiziellen Stränge während der Zellteilung an die mutierte Stelle binden und dort einen Doppelstrang mit der zelleigenen DNA bilden. Somit liegt dieser Teil der Erbinformation nicht mehr, wie von der Zelle erwartet, als Einzelstrang vor und der Abschluss der Zellteilung wird dadurch gestört. Dieser Ansatz ist theoretisch sehr gut, da keinerlei Nebenwirkungen wie bei konservativen Krebsbehandlungen zu erwarten sind. Ein Problem ist jedoch, dass nur ein geringer Teil der injizierten DNA-Stränge tatsächlich am Zellkern ankommt und sich dort mit der eigentlichen Erbinformation verbinden kann. Denn zelleigene Enzyme bauen diese “Fremdkörper” auf ihrem Weg zum Nukleus ab. Um die Widerstandsfähigkeit der DNA-Stränge zu erhöhen, kann man diese zu einer Haarnadelschleife formen. Dafür werden die zur Therapie nötigen DNA-Sequenzen um einige komplementäre Basenpaare an beiden Enden des Strangs erweitert, die dann den Stamm der Haarnadel bilden. Durch die Modifikation der Einzelstränge kann die Effektivität der Medikamente gesteigert werden. Bisher ist das Verhalten dieser DNA-Stränge sehr genau in wässriger Lösung bekannt, jedoch existierten noch keinerlei Informationen wie sich die Haarnadelschleifen in einer zellähnlichen Umgebung verhalten.

[Bildunterschrift / Subline]: Schemazeichnung des Zellinneren: Diese Illustration eines Escheria coli Bakteriums von David Goodsell aus dem Jahr 1998 macht deutlich wie dicht gedrängt Proteine (blau), Ribosomen (violett) und andere Strukturen im Zellinneren sind. Die große Makromoleküldichte mit Konzentrationen von mehr als 300mg/ml beeinflussen nicht nur die Bewegung innerhalb der Zelle, sondern wirkt sich auch auf Reaktionen der Zellbestandteile untereinander aus. Deshalb wurden unsere Fluoreszenzexperimente der DNA-Stränge in Lösungen mit sehr hohen Makromoleküldichten durchgeführt.

Um genau das untersuchen zu können, muss man erstens die Kinetik der Haarnadeln durch gewisse Parameter charakterisieren und zweitens ist es nötig ein möglichst einfaches System zu wählen, dass dem Zytoplasma einer Zelle trotzdem sehr nahekommt. Da es sich bei den Haarnadeln um temporäre Konformationen handelt, wurden nach [1] die folgenden beiden Parameter verwendet, um ihre Kinetik zu beschreiben: 1) Die Zeit, die nötig ist bis sich eine Haarnadel ausbildet und wieder öffnet und 2) der Anteil der Haarnadeln, der im Mittel innerhalb einer Probe in der offenen Konformation vorliegt. Der von mir verwendete Zugang zu diesen beiden Größen ist die sogenannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Dafür wurden die DNA Stränge mit fluoreszenten Farbstoffen markiert und in einer Lösung untersucht. Ein geeignetes und den Proteinen im Zellinneren in seiner Struktur sehr ähnliches Makromolekül ist Dextran, welches in sehr hohen Konzentrationen (bis zu 400g/l) in Wasser gelöst wurde. Die durchgeführten Experimente haben gezeigt, dass im Vergleich zur Kinetik in wässriger Lösung das Ausbilden und wieder Lösen der DNA-Haarnadelstränge in Dextranlösungen stark verlangsamt ist. Da die Mitose jedoch innerhalb von Minuten abläuft, beeinflusst dies die Wechselwirkungswahrscheinlichkeit mit der körpereigenen DNA kaum. Interessant ist jedoch, dass in Dextranlösung mindestens doppelt so viele DNA-Stränge in geschlossener Konformation, also als Haarnadelschleife vorliegen im Vergleich zu Referenzmessungen in Wasser. Weiterführende Experimente haben gezeigt, dass dieser starke Effekt nicht nur auf die besonders große Moleküldichte in der Lösung zurückzuführen ist, sondern auf die besondere Form der Bewegung innerhalb dieser Moleküllösung. Dort findet die sogenannte anomale Diffusion statt, was auf die viskoelastischen Eigenschaften der in der Zelle gelösten Makromoleküle zurückzuführen ist [2].

Insgesamt haben die durchgeführten Fluoreszenzexperimente gezeigt, dass Haarnadelschleifen in einer zellähnlichen Umgebung die geschlossene Konformation stark bevorzugen. Unter Umständen könnte dieses Resultat für eine Erweiterung der sogenannten antisense therapy von Bedeutung sein.

[1] G. Bonnet, O. Krichevsky and A. Libchaber: Kinetics of conformational fluctuations in DNA-hairpin-loops. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95:8602-8606, July 1998.

[2] O. Stiehl, K. Weidner-Hertrampf and M. Weiss: Kinetics of conformational fluctuations in DNA hairpin-loops in crowded fluids. New Journal of Physics, in press 2013.


mailto: Olivia Stiehl
Olivia Stiehl
* 1987

Wissenschaftlicher Werdegang
  • 2007 - 2012
  • Diplomstudiengang Physik, Universität Bayreuth
  • seit 05/2012
  • Promotion am Lehrstuhl „Experimentalphysik I“ bei Professor Dr. Matthias Weiss an der Universität Bayreuth
  • 2009-2013
  • Teilnahme am Studienprogramm „Macromolecular Science“ im Rahmen des Elitenetzwerks Bayern

Preise und Auszeichnungen
  • * EPL-Posterpreis, Konferenz “Frühjahrstagung der Deutschen Physikalischen Gesellschaft”, 25.-30. März 2012, Berlin

Publikationen
  • * Stiehl O., Weidner-Hertrampf K. and Weiss M., Kinetics of conformational fluctuations in DNA hairpin loops in crowded fluids, New Journal of Physics, in press 2013.