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Forschungsarbeit

Ungewöhnliche Radikalenzyme im Aminosäurestoffwechsel von Clostridien

von Stefan Knauer (5.11.2010)

Enzyme, die Reaktionen in biologischen Systemen mittels Radikalmechanismen ka­talysieren, gewinnen immer mehr an Bedeutung. Sie werden auf Grund ihres Reak­tionsmechanismus als Radikalenzyme bezeichnet. Bei Radikalmechanismen treten während des Reaktionsverlaufes radikalische Spezies auf, d.h. chemische Spezies mit einem ungepaarten Elektron, die hoch reaktiv sind. Dies stellt eine Herausfor­derung für die Enzyme dar, da die Radikale wegen ihrer Reaktivität stark kontrolliert werden müssen.

In meiner Doktorarbeit beschäftige ich mich speziell mit Radikalenzymen, die vor allem in Clostridien vorkommen. Diese Enzyme gehören zur Familie der so genannten 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen und katalysieren chemisch be­sonders schwie­rige Reak­tionen im Stoffwechsel dieser Bakterien. Sie enthalten neben den organischen Ami­nosäuren auch anorganische Bestandteile, die aus Ei­sen-Schwefel-Verbindungen bestehen, so genannte Eisen-Schwefel-Cluster (Abb. 1). Aus diesem Grund ge­hören diese En­zyme auch zu der Gruppe der Eisen-Schwefel-Proteine. Eisen-Schwefel-Proteine sind essentiell für alle Lebewesen, da sie an allen wichtigen Stoffwechselprozessen beteiligt sind und diese nicht ohne Eisen-Schwefel-Proteine ablaufen können. Zu diesen Stoffwechselprozessen gehören bei­spielsweise die At­mung der Tiere, die Photosynthese der Pflanzen oder die Stickstofffixierung der Knöllchenbakterien in Erbsenwurzeln. Die in den Proteinen enthaltenen Eisen-Schwefel-Cluster kommen in unterschiedlichen Strukturen vor, da sie je nach Anzahl der beteiligten Eisen- und Schwefelatome lineare, kubische oder komplexere Reaktionszentren bilden.

 

Abb. 1: Kubischer Eisen-Schwefel-Cluster. Eisenatome sind in orange dargestellt, Schwefelatome in gelb.[Bildunterschrift / Subline]: Abb. 1: Kubischer Eisen-Schwefel-Cluster. Eisenatome sind in orange dargestellt, Schwefelatome in gelb.

Eisen-Schwefel-Proteine, deren Cluster an Katalyse-Prozessen beteiligt sind, in de­nen die Abspaltung von Wasser (Dehydratisierung) erfolgt, sind seit etwa 40 Jahren bekannt. Das bekannteste Beispiel ist das Enzym Aconitase, das im Zitronesäurezy­klus die Umwandlung von Zitrat zu Isocitrat durch Abspaltung und Wiederanlage­rung von Wasser katalysiert.

Eisen-Schwefel-Cluster kommen jedoch nicht nur in aeroben Prozessen - d.h. in der Anwesenheit von Sauerstoff – vor. Sie spielen auch besonders wichtige Rollen im Stoffwechsel anaerober Bakterien. Zu dieser Klassen von Bakterien gehören die Clo­stridien, von denen einige Vertreter – unter anderem das humanpathogene Bakte­rium Clostridium difficile – mit Hilfe von Eisen-Schwefel-Proteinen bestimmte Ami­nosäuren zur Energiegewinnung nutzen können. Clostridien können nur in sau­er­stofffreier Umgebung existieren, also z.B. im Verdauungstrakt von Säugetieren. Dementsprechend sind auch die Enzyme auf eine sauerstofffreie Umgebung ange­wiesen.

Clostridium difficile ist nun darauf spezialisiert durch die Fermentation der proteino­genen Aminosäure L-Leucin Energie zu gewinnen. Hierfür wird das Eisen-Schwefel-Enzym 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (2-ISODH) benötigt. Dieses Enzym katalysiert die Wasserab­spaltung (Dehydratisie­rung) aus (R)-2-Hydroxyisoca­proyl-CoA. Dies ist aus chemischer Sicht eine schwierige Reak­tion, da es eine so ge­nannte b,a-Eliminierung ist. Aus diesem Grund werden diese Enzyme auch als atypische Dehydratasen bezeichnet. Um dennoch diesen Schritt katalysieren zu können, ver­wendet dieses Enzym einen Radikalmechanismus. Insgesamt können von an­aerob lebenden Mikro­orga­nismen zwölf der proteino­genen Aminosäuren zur Energiegewinnung verwen­det werden. Die Enzyme, die in den verschiedenen Stoffwechselwegen die schwierige Wasserabspaltung katalysieren, werden allgemein als 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydra­tasen bezeichnet und sind alle Radikalenzyme (Abb. 2). Eine Besonderheit der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen ist, dass sie im Gegen­satz zu den meisten anderen Radikalenzymen keine komplexen Kofaktoren (wie z.B. Coenzym B12 oder S-Adeno­sylmethionin) zur Generierung des aktiven Radikals be­nötigen.

[Bildunterschrift / Subline]: Abb. 2: Wasserabspaltung, die von den 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen katalysiert wird. SCoA steht für Coenzym A.

Die 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen bestehen aus zwei Komponenten: einem Ak­tivatorprotein und der eigentlichen Dehydratase. Beide Komponenten enthalten Ei­sen-Schwefel-Cluster. Das Aktivatorprotein überträgt unter Energieaufwand (ATP-Hydrolyse) ein Elektron auf die Dehydratase und „aktiviert“ diese somit. Sobald die Dehydratase aktiviert ist, kann sie im Fall der 2-ISODH bis zu 10000 Wasserab­spaltungen katalysieren. Dies ist möglich, da nach jeder einzelnen Wasserabspal­tung das reaktive Elektron, das für die Katalyse benötigt wird, wiedergewonnen wird (Abb. 3). Wie die Aktivierung und die Katalyse auf molekularer Basis ablaufen ist bislang unbekannt. Weiterhin ist bislang ungeklärt, wie das Elektron nach jeder De­hydratisierung wiedergewonnen wird und wie der zufällige Verlust des Elektrons verhindert wird.

[Bildunterschrift / Subline]: Abb. 3: Katalysezyklus der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen.

Meine Arbeit besteht nun darin, die 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen aus verschie­denen Mikroorganismen in einem ungefährlichen Bakterienstamm (Escherichia coli) zu produzieren und sie daraus zu isolieren. Anschließend charakterisiere ich sie bio­chemisch mittels verschiedener biophysika­lischer Techniken, beispielsweise durch unterschiedliche Spektroskopiearten. Au­ßerdem versuche ich, ihre dreidimen­sionale Struktur, d.h. die Anordnung der Atome im Enzym, in verschiedenen Zu­ständen mit Hilfe einer Methode aufzuklä­ren, die sich Röntgenstrukturanalyse nennt. Hierzu wer­den die Proteine kristalli­siert und die Kristalle werden anschließend Röntgenbeugungs-Experimenten unterzo­gen. Aus den resultierenden Daten kann ein Modell der dreidimensionalen Struktur erzeugt wer­den. Die Enzyme sind hochgradig sauerstoffempfindlich, d.h. sie sind auf eine sau­erstofffreie Umgebung angewiesen. Somit müssen alle Arbeiten mit ihnen unter dem Ausschluss von Sauerstoff stattfinden, was besondere Maßnahmen erfor­dert (Abb. 4).

Schließlich werden alle experimentellen Daten dazu verwendet, die Funktionsweise dieser besonderen Enzyme auf molekularer Basis zu entschlüsseln.

Abb. 4: Handschuhkasten, der das Arbeiten unter Ausschluss von Sauerstoff ermöglicht. In dem Handschuhkasten befinden sich Geräte für die Isolierung von Proteinen.[Bildunterschrift / Subline]: Abb. 4: Handschuhkasten, der das Arbeiten unter Ausschluss von Sauerstoff ermöglicht. In dem Handschuhkasten befinden sich Geräte für die Isolierung von Proteinen.

Stationen
  • seit 2007
  • Promotion in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. H. Dobbek, Bioanorganische Chemie an der Universität Bayreuth und Strukturbiologie / Biochemie an der Humboldt-Universität zu Berlin
  • Mitglied im internationalen Doktorandenkolleg „Leitstrukturen der Zellfunktion“
  • 2006-2010
  • Mitglied im Elitestudienprogramm „Macromolecular Science“
  • 2002-2007
  • Biochemie-Studium an der Universität Bayreuth
  • 2001
  • Abitur am Gymnaisum Ernestinum Coburg

Stipendien
  • 2007-2009
  • Doktorandenstipendium der Stiftung Stipendien-Fonds des Verbandes der Chemischen Industrie e.V.
  • 2004-2007
  • Stipendium der Stiftung der Deutschen Wirtschaft
  • 2002-2004
  • Stipendium der Stiftung Stipendien-Fonds des Verbandes der Chemischen Industrie e.V.

Veröffentlichungen
  • Spiegelhauer O, Mende S, Dickert F, Knauer SH, Ullmann GM, Dobbek H: „Cysteine as a modulator residue in the active site of xenobiotic reductase A: a structural, thermodynamic and kinetic study“, J Mol Biol (2010) 398: 66-82