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Forschungsarbeit

Funktionsweise der molekularen Transkriptions-Maschine der Gene

von Florian Brückner (30.03.2009)

Die wichtigsten molekularen Bestandteile eines biologischen Organismus sind die Proteine, die vielfältige Funktionen erfüllen und damit erst Leben ermöglichen. Bauanleitungen für die Proteine sind in Form der Gene im Erbgut der Zellen hinterlegt. Für die Herstellung eines Proteins wird eine Abschrift des entsprechenden Gens benötigt, welche von der komplexen Transkriptions-Maschine Pol II angefertigt wird. Ich untersuchte Aspekte der Funktionsweise der nur einige Nanometer großen Pol II u. a. mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse. Die gewonnenen Erkenntnisse verwendeten wir, um einen Film der Gen-Kopiermaschine bei der Arbeit zu drehen, welcher das Verständnis dieses zentralen Lebensprozesses erleichtern soll. Wir konnten auch beobachten, wie die Pol II Beschädigungen der Gene erkennen kann und damit zur körpereigenen Prävention von Krebs beiträgt und wie das Gift des Grünen Knollenblätterpilzes wirkt, indem es die Pol II spezifisch blockiert.

Die Erbinformation eines Lebewesens ist in Form der so genannten Desoxyribonukleinsäure (DNS) gespeichert, einem kettenförmigen Molekül, dessen Informationsgehalt durch die Abfolge von dessen vier unterschiedlichen Bausteinen bestimmt wird (Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin). Die Erbinformation enthält im Wesentlichen alle nötigen Informationen zur Entwicklung, zum Aufbau und zur Funktionsweise eines Lebewesens und spiegelt dessen Komplexität wieder. In mehrzelligen Organismen ist die gesamte Erbinformation im Zellkern jeder Zelle gespeichert.  Die funktionellen Einheiten der Erbinformation, welche im Zusam-menhang mit konkreten vererbbaren Eigenschaften stehen, bezeichnet man als Gene, von denen der Mensch ca. 30.000 besitzt. Auf molekularer Ebene enthält ein Gen meist die Bauanleitung für jeweils ein bestimmtes Protein (= Eiweißmolekül), sowie die Information wann und wo das entsprechende Protein benötigt wird. Proteine sind für einen Organismus die in funktioneller Hinsicht vielfältigste und wichtigste Gruppe der großen biologischen Moleküle. Sie formen als stützende Bauelemente unsere Zellen und Organe und spielen in allen wichti-gen Lebensprozessen wie Wachstum und Entwicklung, Stoffwechsel, Stofftransport und Signalübermittlung eine herausragende Rolle, indem sie z.B. chemische Prozesse ermöglichen und steuern, den Transport von Molekülen durchführen und steuern, sowie Signalstoffe erkennen oder selbst als Signalüberträger fungieren. Jedes der vielen tausend verschiedenen Proteine eines Lebewesens erfüllt dabei eine spezifische Funktion.
Für die Herstellung eines bestimmten Proteins in der Zelle wird zunächst eine Kopie von dessen Bauanleitung benötigt. Dafür wird eine Abschrift des entsprechenden Gens angefertigt, ein Prozess der als Gen-Transkription bezeichnet wird. Dabei wird derjenige Abschnitt der DNS abgelesen, welcher die Bauanleitung enthält und eine Abschrift in Form der so genannten Boten-Ribonukleinsäure (Boten-RNS) synthetisiert, welche chemisch fast identisch aufgebaut ist wie die DNS-Vorlage. Die "Abschreibarbeit" erledigt dabei eine so genannte RNS-Polymerase, eine winzige komplexe Maschine, die nur einige Nanometer (Millionstel Millimeter) misst und selbst ein Protein ist. In höheren Organismen (im Gegensatz zu Bakterien) befindet sich die Erbinformation im Zellkern und protein-kodierende Gene werden von der spezialisierten RNS-Polymerase II (Kurzform Pol II) transkribiert. Die Boten-RNS wird daraufhin zu den so genannten  Ribosomen transportiert, die sich außerhalb des Zellkerns befinden und so etwas wie die Protein-produzierenden Maschinen der Zelle sind (auch sie bestehen selbst zu einem großen Teil aus Protein-Bauteilen). Die Ribosomen synthetisieren dann unter Verwendung der Boten-RNS als Vorlage eine Aminosäurekette, die sich schließlich zu einer dreidimensionalen Struktur faltete, um ein funktionsfähiges Protein zu bilden.
Um sicherzustellen, dass ein Protein nur dann produziert wird, wenn es benötigt wird, wird die Pol II von einer äußerst komplexen Maschinerie gesteuert, die wiederum aus vielen verschiedenen Proteinen besteht und ein wichtiges Kontrollzentrum der Zelle darstellt.
Für ein fundamentales Verständnis der Funktionsweise einer Protein-Nanomaschine wie der Pol II ist es unerlässlich, deren Struktur zu analysieren. Proteine sind nur einige Millionstel Millimeter groß und damit in der Regel kleiner als die Wellenlänge des sichtbaren Lichts, weshalb sich ein Lichtmikroskop hierfür nicht eignet. Die Röntgenstrukturanalyse hingegen erlaubt dreidimensionale Einblicke in atemberaubendem Detail. Hierfür muss es aber gelingen, aus vielen Millionen Proteinmolekülen bestehende Protein-Kristalle zu züchten, um diese dann mit Röntgenlicht zu durchleuchten (Abb. 1). Das Ergebnis dieser Methode ist phänome-nal. Es gelingt, die exakten Positionen der Atome, aus welchen ein Protein besteht, im Raum zu bestimmen (bei der Pol II sind das ca. 60.000!). Die erste atomare Strukturbestimmung der Pol II gelang meinem Doktorvater Patrick Cramer im Jahre 2001 im Labor von Roger Korn-berg, der dafür 2006 den Nobelpreis für Chemie bekam [1].

Proteinkristalle unter dem Lichtmikroskop.[Bildunterschrift / Subline]: Abbildung 1: Proteinkristalle unter dem Lichtmikroskop. Es handelt sich um Kristalle der RNS-Polymerase II. Die größten unter ihnen haben einen Durchmesser von maximal 0.5 mm.

Um jedoch im Detail zu verstehen, wie eine komplexe Protein-Maschine, wie die Pol II tatsächlich funktioniert, muss diese bei der Arbeit beobachtet werden. Da die Röntgenstrukturanalyse statische Bilder liefert, ist es notwendig, verschiedene Zustände während des Arbeitszyklus als "Schnappschüsse" festzuhalten. Die Schwierigkeit besteht darin, die Protein-Maschine während der Arbeit in einem bestimmten Zustand anzuhalten, um die 3D-Strukturanalyse durchführen zu können.

Die Erforschung der Funktionsweise der Pol II beschäftigt schon seit deren Entdeckung in den 1960er Jahren viele Wissenschaftler auf der ganzen Welt. Der Mechanismus, mit welcher die Pol II sich während der Transkription an der DNS-Vorlage entlang bewegt, die so genannte Translokation, stellte zu Beginn meiner Doktorarbeit einen der am wenigsten verstandenen Sachverhalte dar. Der eigentliche Gen-Abschreibvorgang findet im so genannten "Aktiven Zentrum" der Pol II statt und besteht aus dem Auslesen eines DNS Bausteins und dem "Schreiben" eines RNS-Bausteins, was durch den Einbau eines komplementären Bausteins in die RNS durch eine chemische Reaktion geschieht [hierbei ist Adenin (A) komplementär zu Thymin (T) bzw. Uracil (U, Uracil ersetzt Thymin in der RNS); Guanin (G) ist komplementär zu Cytosin (C) und jeweils umgekehrt]. Da die abzuschreibenden Gene hunderte bis tausende Bausteine umfassen und die Pol II jeweils nur einen Baustein zur gleichen Zeit bearbeiten kann, muss das Aktive Zentrum und mit ihm die gesamte Pol II sich Baustein für Baustein entlang der DNS-Vorlage bewegen (translozieren). Ein Arbeitszyklus der Pol II besteht also aus dem Auslesen eines DNS-Bausteins, dem Schreiben des komplementären RNS-Bausteins und der Translokation zum nächsten auszulesenden DNS-Baustein.

Mit Hilfe des Giftes des Grünen Knollenblätterpilzes, des α-Amanitins, gelang es uns, die Pol II während dieses Translokationsprozesses anzuhalten (Abb. 2) [2]. Die spezielle Struktur dieser angehaltenen Pol II ließ uns schlussfolgern, dass die Translokation in zwei Stufen abläuft und dass zwei Elemente der Pol II wesentliche Rollen spielen, die so genannte "Brücken-Helix" (grün in Abb. 2) und die "Auslöser-Schleife" (dunkelrot in Abb. 2).

Struktur der durch das Pilzgift alpha-Amanitin blockierten Pol II.[Bildunterschrift / Subline]: Abbbildung 2: Struktur der durch das Pilzgift alpha-Amanitin blockierten Pol II. Die Struktur der Pol II ist in der stark vereinfachten so genannten Bänderdarstellung in grau gezeigt. Die das Protein aufbauende Aminsäurekette ist dabei als Band bzw. Schnur dargestellt. Die für den Mechanismus der RNS-Synthese wichtigen Elemente Brücken-Helix (grün) und Auslöser-Schleife (dunkelrot) sind farblich hervorgehoben. Die DNS-Vorlage ist als Schlauch in dunkelblau gezeigt, die neu entstehende Boten-RNS in rot. Die einzelnen Bausteine sind als Stäbchen gezeigt. Die DNS liegt in Form einer Doppelhelix vor und besitzt deshalb auch einen Komplementärstrang, der in hellblau zu sehen ist und welcher während der Transkription temporär von der Vorlage getrennt werden muss, um das Auslesen zu ermöglichen. Ein Magnesium-Ion (Mg) im Aktiven Zentrum ist als Kugel in pink dargestellt. Das Gift des Grünen Knollenblätterpilzes ist in orange dargestellt. Es bindet die Brücken-Helix und die Auslöser-Schleife nicht weit vom Aktiven Zentrum und blockiert so die Pol II bei der Arbeit.

Die so gewonnenen Einsichten verwendeten wir zusammen mit einer Reihe weiterer Schnappschüsse, die z. T. auch aus anderen Laboren stammten, um das gegenwärtige Modell für den Mechanismus des Pol II-Arbeitszyklus zu erweitern (Abb. 3) und einen Film der Pol II bei der Arbeit zu kreieren (Abb. 4) [3]. Der Film soll das Verständnis der Funktionsweise dieser für das Leben so zentralen molekularen Maschine entsprechend unserer gegenwärtigen Erkenntnis erleichtern.

Schematische Darstellung des von uns vorgeschlagenen Modells für den Arbeitszyklus der Pol II.[Bildunterschrift / Subline]: Abbildung 3: Schematische Darstellung des von uns vorgeschlagenen Modells für den Arbeitszyklus der Pol II. Eine grafische Darstellung des Modells ist rechts dargestellt. Die Position im Aktiven Zentrum, an welcher der eigentliche Transkriptions-Vorgang stattfindet ist durch eine senkrechte gestrichelte Linie dargestellt. Die aufgrund von strukturellen Untersuchungen postulierten Zustände der Pol II während des Arbeitszyklus sind in der Mitte in rot aufgelistet. Die Ereignisse, die zum Übergang von jeweils einem Zustand zum nächsten führen, sind ganz links in schwarz aufgelistet.

Der Film zeigt in Nahaufnahme das Aktiven Zentrums der Pol II während des kompletten Arbeitszyklus (Abb. 4) und veranschaulicht auf diese Weise den Mechanismus. Während eines Arbeitszyklus wird ein Baustein in der DNS-Vorlage (dunkelblau) ausgelesen (Abb. 4, eingekreist) und in der Folge wird der komplementäre Baustein (orangefarbener Baustein) in die Boten-RNS (rot) eingebaut. Der Zyklus schließt mit der Translokation der Pol II, um den nächsten auszulesenden Baustein (violett) in das aktive Zentrum in Position zu bringen. Die Pol II Elemente Brücken-Helix (grün) und Auslöser-Schleife (dunkelrot) bewegen sich während des Arbeitszyklus und sind wesentlich am Mechanismus des Einbaus in die RNS und der Translokation beteiligt, wie der Film im Detail zeigt.

Film der Pol II bei der Arbeit.[Bildunterschrift / Subline]: Abbildung 4: Film der Pol II bei der Arbeit. Repräsentative Standbilder aus dem Film sind in chronologischer Reihenfolge dargestellt und nummeriert. Diese Standbilder entsprechen postulierten Zuständen im Arbeitszyklus, für welche strukturelle Untersuchungen durchgeführt wurden (vgl. Abb. 3). Die Farbkodierung ist identisch mit Abb. 2 und 3. Die Bilder 1 bis 7 zeigen einen kompletten Arbeitszyklus, Bild 1' zeigt bereits wieder den Ausgangszustand für den darauf folgenden Arbeitszyklus. Der eingekreiste Baustein der DNS wird ausgelesen, ein dazu komplementärer Baustein, in orange dargestellt, wird in die Boten-RNS eingebaut. Sobald er Teil der Boten-RNS geworden ist, ist er rot dargestellt. Durch die Translokation der Pol II wird der nächste auszulesende Baustein (in violett dargestellt) ins Aktive Zentrum transportiert. Für eine genauere Erklärung siehe Text und Abb. 3.

Ein weiterer Forschungsschwerpunkt meiner Dissertation steht im Zusammenhang mit Beschädigungen der DNS, welche z.B. durch Umwelteinflüsse hervorgerufen werden. Während der Transkription von Genen kann die Pol II einige Arten dieser Schäden erkennen. Hierzu gehören Schäden, die durch eine unkonventionelle zusätzliche starre Verknüpfung zweier benachbarter DNS-Bausteine verursacht sind. Im Fall der so genannten UV-Photoschäden wird diese Verknüpfung durch UV-Strahlung hervorgerufen. Dies passiert besonders häufig in den der Sonne exponierten Hautzellen und ist eine der Hauptursachen für die Entstehung von Hautkrebs. Die effiziente Erkennung dieses Schadens durch Pol II erzeugt ein Signal in der Zelle, welches die Reparatur des Schadens veranlasst. Dieses ausgeklügelte System, in welchem die Pol II eine zentrale Rolle spielt, ist somit maßgeblich an der Verhinderung von Hautkrebs beteiligt.

Mechanismus der Erkennung eines UV-Photoschadens durch Pol II.[Bildunterschrift / Subline]: Abbildung 5: Mechanismus der Erkennung eines UV-Photoschadens durch Pol II. Schematische Darstellung der UV-Photoschaden-Erkennung durch Pol II. Nahaufnahmen der Strukturen des Aktiven Zentrums im Zustand 1 (Schaden vor dem Aktiven Zentrum) und Zustand 3 (Schaden im Aktiven Zentrum) sind dargestellt. Im Aktiven Zentrum wird der Schaden erkannt, da er den Einbau eines nicht-komplementären RNS-Bausteins bewirkt. Für eine genauere Erklärung siehe Text.

Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse und komplementären biochemischen Experimenten gelang es uns, den detaillierten Mechanismus aufzuklären, der zur Erkennung von UV-Schäden führt [4,5]. Während der Transkription gelangt der UV-Schaden ungehindert bis kurz vor das Aktive Zentrum der Pol II (Abb. 5, Zustand 1). Der direkt vor dem Schaden liegende Baustein kann noch ungehindert ausgelesen werden und führt zu einem korrekten (komplementären) Einbau eines Bausteins in die RNS (Abb. 5, Zustand 2). Beim Versuch, die unnatürlich verknüpften Bausteine zu transkribieren, wird der Schaden jedoch erkannt. Der aus zwei Bausteinen (hier zwei Thymine) bestehende sperrige Schaden passt zunächst nicht ins Aktive Zentrum. Dies führt dazu, dass die Pol II zunächst einen Baustein "blind" einbaut (Abb. 5, Zustand 3), was bereits zu einer Verzögerung führt. [Der Blindeinbau erfolgt gegenüber dem ersten geschädigten Thymin. Es stellte sich heraus, dass die Pol II beim Blindeinbau bevorzugt Adenin verwendet, was im Fall der Thymin-Photoschäden zufällig der komplementäre Baustein ist.] Wenn der Schaden nach diesem Blindeinbau im Aktiven Zentrum Platz gefunden hat, ist aber die Orientierung des nächsten auszulesenden Bausteins [des zweiten geschädigten Bausteins] durch die spezielle Form des Schadens so verändert, dass die Pol II beim Auslesen einen Fehler macht und einen falschen (nicht-komplementären) Baustein in die Boten-RNS einbaut (Abb. 5, Zustand 4). Genau dieser Fehler führt letztendlich zu einer kompletten Blockade der Pol II und damit zur Erkennung des Schadens.
Das Krebsmedikament Cisplatin erzeugt ebenfalls DNS-Schäden durch eine starre Verknüpfung zweier benachbarter DNS-Bausteine, welche sich in ihrer Art jedoch von der im UV-Photoschaden unterscheidet. Dadurch sollen die Krebszellen von der Teilung abgehalten werden, bei welcher die komplette Erbinformation kopiert werden muss. Jedoch auch diese Schäden können bei der Transkription von Pol II erkannt und in der Folge repariert werden, was in diesem Fall aber negative Folgen für die menschliche Gesundheit hat, da es den Tumor gegen diese Art der Chemotherapie resistent macht.
Wir konnten zeigen, dass der Erkennungsmechanismus für den Cisplatin-Schaden durch Pol II sich vom Erkennungsmechanismus der UV-Schäden trotz der prinzipiellen Ähnlichkeit der zwei Arten von Schäden unterscheidet [6]. Der Cisplatin-Schaden wird bereits wirksam daran gehindert, in das Aktive Zentrum der Pol II zu gelangen und führt bereits deshalb zu einer Blockade der Transkription. Der Grund dafür ist anscheinend, dass dieser Schaden noch größeren Ausmaße als der UV-Schaden besitzt. Die darauf folgenden Reparaturprozesse sind jedoch vermutlich identisch.
Struktur-Funktions-Untersuchungen, wie die hier beschriebenen, haben wesentlich zum molekularen Verständnis der Funktionsweise der Transkriptionsmaschine Pol II beigetragen [7]. Viele weitere Details der Pol II-Funktion sind jedoch bis heute unverstanden. Der Umgang von Pol II mit durch Sauerstoffradikale erzeugte DNS-Schäden ist nur unzureichend untersucht und ist ebenfalls von medizinischer Bedeutung, da diese Schäden möglicherweise zu fehlerhaften Genabschriften führen. Die Pol II führt ihre "Abschreib-Arbeit" erstaunlich genau durch, doch der Mechanismus, durch welchen sie eine derart hohe Genauigkeit erreicht, muss noch genauer charakterisiert werden. Eine weitere große Herausforderung ist auch die Erforschung der Funktionsweise der die Pol II kontrollierenden und regulierenden Elemente der Zelle. Die Transkription der Gene ist einer der fundamentalsten Lebensprozesse und viele menschliche Krankheiten, insbesondere auch Krebs, stehen im Zusammenhang mit krankhaften Veränderungen in diesem Prozess. Ein tiefgreifendes mechanistisches Verständnis der Transkription ist deshalb eine grundlegende Voraussetzung für die Entwicklung von wirksamen Therapien gegen bis heute nicht oder nur unzulänglich behandelbare Krankheiten.

Referenzen

1. Cramer P, Bushnell DA, Kornberg RD: Structural basis of transcription: RNA poly-merase II at 2.8 angstrom resolution. Science 2001, 292:1863-1876.
2. Brueckner F, Cramer P: Structural basis of transcription inhibition by alpha-amanitin and implications for RNA polymerase II translocation. Nat Struct Mol Biol 2008, 15:811-818.
3. Brueckner F, Ortiz, J., Cramer, P.: A movie of the RNA polymerase nucleotide addition cycle. Curr Opin Struct Biol 2009:submitted.
4. Brueckner F, Cramer P: DNA photodamage recognition by RNA polymerase II. FEBS Lett 2007, 581:2757-2760.
5. Brueckner F, Hennecke U, Carell T, Cramer P: CPD damage recognition by transcribing RNA polymerase II. Science 2007, 315:859-862.
6. Damsma GE, Alt A, Brueckner F, Carell T, Cramer P: Mechanism of transcriptional stalling at cisplatin-damaged DNA. Nat Struct Mol Biol 2007, 14:1127-1133.
7. Brueckner F, Armache KJ, Cheung A, Damsma GE, Kettenberger H, Lehmann E, Sydow J, Cramer P: Structure-function studies of the RNA polymerase II elongation com-plex. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2009, 65:112-120.


Stationen
  • seit Jan. 2009
  • Postdoc in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. So Iwata am Imperial College London, England
  • Jun. 2008 - Dez. 2008
  • Postdoc in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Patrick Cramer, Genzentrum, Ludwig-Maximilians-Universität München
  • Jun. 2004 - Mai 2008
  • Doktorarbeit in Strukturbiologie in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Patrick Cramer, Genzentrum, Ludwig-Maximilian-Universität München
  • Nov. 1998 - März 2004
  • Diplomstudium der Biologie, Technische Universität München, Diplomarbeit in Strukturbiologie in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Arne Skerra, Technische Universität München,

Auszeichnungen
  • Römerpreis 2007 vom Department Chemie und Biochemie, Ludwig-Maximilians-Universität München in der Kategorie Dissertation

Veröffentlichungen
  • Brueckner, F., Ortiz, J., Cramer, P. A movie of the RNA polymerase nucleotide addition cycle. Curr Op Struct Biol, in press.
  • Brueckner, F., Armache, K.-J., Cheung, A., Damsma, G. E., Kettenberger, H., Lehmann, E., Sydow, J. and Cramer, P. (2009). Structure-function studies of the RNA polymerase II elongation complex. Acta Cryst D 65, 112-120.
  • Muschielok, A., Andrecka, J., Jawhari, A., Brueckner, F., Cramer, P. and Michaelis, J. (2008). A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat. Methods 5, 965-971.
  • Brueckner, F., Cramer, P. (2008). Structural basis of transcription inhibition by alpha-amanitin and implications for RNA polymerase II translocation. Nat Struct Mol Biol. 15, 811-818.
  • Cramer, P., Armache, K.-J., Baumli, S., Benkert, S., Brueckner, F. et al. (2008). Structure of Eukaryotic RNA Polymerases. Annu. Rev. Biophys. 37, 337-352.
  • Andrecka, J., Lewis, R., Brueckner, F., Lehmann, E., Cramer, P., Michaelis, J. (2008). Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 135-140.
  • Damsma, G., Alt, A., Brueckner, F., Carell, T., Cramer, P. (2007). Mechanism of transcriptional stalling at cisplatin-damaged DNA. Nat Struct Mol Biol 14, 1127-33.
  • Lehmann, E., Brueckner, F., Cramer, P. (2007). Molecular basis of RNA-dependent RNA polymerase II activity. Nature, 450, 445-449.
  • Brueckner, F. et al (2007). The crystal structure of the human heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. J Mol Biol 370, 887-898.
  • Kashkina, E., Anikin, M., Brueckner, F., Lehmann, E., Kochetkov, S.N., McAllister, W.T., Cramer, P., Temiakov, D. (2007). Multisubunit RNA polymerases melt only a single DNA base pair downstream of the active site. J Biol Chem 282, 21578-21582.
  • Brueckner, F., Cramer, P. (2007). DNA photodamage recognition by RNA polymerase II. FEBS Lett 581, 2757-2760.
  • Brueckner, F., Hennecke, U., Carell, T., Cramer, P. (2007). CPD damage recognition by transcribing RNA polymerase II. Science 315, 859-862.
  • Kashkina, E., Anikin, M., Brueckner, F., Pomerantz, R.T., McAllister, W.T., Cramer, P., Temiakov, D. (2006). Template misalignment in multisubunit RNA polymerases and transcription fidelity. Mol Cell 24, 257-266.
  • Kettenberger, H., Eisenfuhr, A., Brueckner, F., Theis, M., Famulok, M., and Cramer, P. (2006). Structure of an RNA polymerase II-RNA inhibitor complex elucidates transcription regulation by noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol 13, 44-48.