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Forschungsarbeit

Regulierte intramembrane Proteolyse-
Ein Mechanismus der extracytoplasmatischen Stressantwort in Bakterien

von Janine Heinrich (02.10.2009)

Die bakterielle Zellwand ist als die äußerste Zellbarriere wechselnden Umweltfaktoren direkt ausgesetzt. Extreme Schwankungen im externen pH-Wert, Osmolarität oder der Temperatur können neben antimikrobiellen Komponenten die strukturelle Integrität der Zellwand gefährden. Gleichzeitig ist die intrazelluläre Weiterleitung von spezifischen extra- oder intrazellulären Signalen ein essentieller Mechanismus, welcher eine Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen ermöglicht. Aktuelle Arbeiten an den Modellorganismen Escherichia coli und Bacillus subtilis deuten auf ein allgemeines und hochkonserviertes Prinzip der Regulation von Genen hin, welches einem Stress auf die Zellwand entgegenwirken. Bei diesem Mechanismus zur Übertragung extrazellulärer Signale in die Zelle, löst ein Stresssignal den regulierten intramembranen proteolytischen (RIP) Abbau eines transmembranen regulatorischen Proteins aus. Solche Signalkaskaden aktivieren alternative Sigmafaktoren zur spezifischen Anschaltung von Genen, die dem Stress entgegenwirken. Ihre Funktionen schließen unter anderem Transport, Sekretion, Biosynthese von Lipopolysacchariden und die Faltung bzw. den Abbau von extrazellulären Proteinen ein. Neuere Arbeiten zeigen, dass sowohl RIP, als auch die spezielle Gruppe von alternativen Sigmafaktoren  mit extracytoplasmatischer Funktion (ECF) eine bedeutende Rolle bei pathogenen Bakterien spielen.

Obwohl fast alle bekannten bakteriellen Genome für ‘intramembrane cleaving‘ Proteasen (iCliPs) codieren, ist bislang wenig über deren Rolle und Funktion bekannt. In meinen Arbeiten habe ich den Mechanismus der intramembranen Proteolyse des anti- Sigmafaktors RsiW des Modellorganismus B. subtilis im Detail analysiert.
Neben dem housekeeping Sigmafaktor SigA verfügt B. subtilis über sieben ECF- Sigmafaktoren: SigX, SigW, SigM, SigV, SigY, SigZ und SigYlaC [5]. Der Sigmafaktor SigA  kontrolliert vor allem die Transkription von allgemein lebensnotwendigen Genen. Dagegen spielen die alternativen Sigmafaktoren bei speziellen Prozessen, z.B. bei der Zelldifferenzierung, Transport und vor allem Stress eine Rolle [4].

Sigmafaktoren als Aktivatoren der Transkription[Bildunterschrift / Subline]: Abbildung 1: Sigmafaktoren als Aktivatoren der Transkription. Das Ersetzen eines Housekeeping- durch alternative Sigmafaktoren ist ein allgemeiner Mechanismus zur Regulation der Promotorselektivität der RNAP, was eine regulierte Transkription spezifischer Gene unter spezifischen Bedingungen zur Folge hat.

Es ist anzunehmen, dass SigW  aus B. subtilis ein Antibiosis Regulon aus ca. 60 Genen kontrolliert, welches durch Defekte in der Zellwandbiosynthese aktiviert wird. In Kultur erfolgt seine Induktion nach Übergang zur frühen stationären Wachstumsphase, durch Zugabe von Zellwandantibiotika (Vancomycin oder Cephalosporin C) [2], antimikrobiellen Peptiden [1], durch NaCl-Stress [8] sowie nach Alkali-Schock oder Infektion mit dem Phagen Spp1 [12]. Die Regulation von SigW erfolgt durch den entsprechenden Anti-Sigmafaktor RsiW, welcher in der Cytoplasmamembran lokalisiert ist und SigW über seine cytoplasmatische, N-terminale Domäne inhibiert [10].
Die folgende Abbildung verdeutlicht den Mechanismus der Aktivierung von SigW bzw. des SigW - Regulons nach spezifischen Stimulus.

Mechanismus zur Aktivierung des SigW - Regulons[Bildunterschrift / Subline]: Abbildung 2: Mechanismus zur Aktivierung des SigW - Regulons. Nach einem spezifischen Stresssignal erfolgt eine Induktion des SigW - Regulons durch sequentiellen Abbau des Anti-Sigmafaktor RsiW (Quelle: Heinrich and Wiegert, 2009).

Mittels aufeinanderfolgender Abbauschritte von RsiW durch zwei Module verschiedener Proteasen in drei verschiedenen Kompartimenten (Zellwand, Cytoplasmamembran und Cytoplasma), kommt es zur Freisetzung von SigW. An der Proteolyse von RsiW ist unter anderem die intramembrane cleaving Protease (iCliP) RasP beteiligt, welche über einen RIP (regulated intramembrane proteolysis) Mechanismus den zweiten sequenzspezifischen proteolytischen Schritt an RsiW katalysiert [10]. Diese Prozessierung (siehe Abbildung 2, Modul 2) ist abhängig von einem vorhergehenden ersten proteolytischen Schritt an der extracytoplasmatischen Domäne von RsiW. In einem Teil meiner Arbeit konnte ich PrsW als die Determinante zum C-terminalen Abbau von RsiW identifizieren und in seiner biochemischen und enzymatischen Funktion charakterisieren [3; Heinrich and Wiegert, unpublished]. Das Transmembranprotein PrsW kann einer ganz neuen Gruppe von potentiellen ‘membrane embedded‘ Metalloproteasen (MEM) zugeordnet werden, über die in B. subtilis bisher keine Informationen verfügbar waren. Neueste Ergebnisse meiner Arbeit zeigen, dass die Prozessierungsstelle nahe dem C-terminalen Ende von RsiW liegt. Dieser spezifische Schnitt macht das Protein dem Abbau durch weitere, bislang unbekannte extracytoplasmatische Proteasen zugänglich (Modul 1, siehe Abbildung) [Heinrich and Wiegert, unpublished]. In einem zweiten proteolytischen Modul wird das verkürzte RsiW durch die bereits erwähnte Protease RasP innerhalb der Membran geschnitten, wodurch der Komplex aus RsiW / SigW ins Cytoplasma entlassen wird. Dort wird der restliche Teil RsiW durch verschiedene cytoplasmatische Proteasen (Clp- Proteasen) vom Sigmafaktor entfernt und es kommt in Folge seiner Freisetzung zur Anschaltung der Stressantwort [13].

Im Zusammenhang der verschiedenen alternativen Sigmafaktoren von B. subtilis, welche um Bindestellen an der RNA-Polymerase konkurrieren, wird die Komplexität prokaryotischer Genregulation auf der Ebene der Transkriptionsinitiation deutlich. Neuere Arbeiten zeigen auch, dass sowohl RIP als auch ECF-Sigmafaktoren eine bedeutende Rolle bei pathogenen Bakterien bzw. Pathogenese [6,7,11] spielen. Die Fragestellung, wie ein Defekt in RIP die Stressresistenz, Antibiosis und Pathogenität von Bakterien wie B. anthracis, Staphylococcus aureus oder Listeria Spezies beeinflusst ist hochinteressant und Gegenstand aktueller Forschung.


Referenzen:
[1]  Butcher, B.G., Helmann, J.D. (2006) Mol. Microbiol. 60, 765-782.
[2]  Cao, M., Wang, T., Ye, R., Helmann, J.D. (2002) Mol. Microbiol. 45, 1267-1276.
[3]  Heinrich, J., Wiegert, T. (2006) Mol. Microbiol. 62, 566-579.
[4]  Helmann, J.D. (2002) Adv. Microbiol. Physiol. 46, 47-110.
[5]  Kunst et al., (1997) Nature 390, 249-256.
[6]  Makinoshima, H., Glickman, M.S. (2006) Microbes. Infect. 8, 1882-1888.
[7]  Matson, J.S., DiRita, V.J. (2005) Proc Natl Acad Sci U. S. A 102, 16403-16408.
[8]  Petersohn et al., (2001) J. Bacteriol. 183, 5617-5631.
[9]  Pietiäinen, et al.,  (2005) Microbiology 151, 1577-1592.
[10]  Schöbel et al., (2004) Mol. Microbiol. 52, 1091-1105.
[11]  Urban, S. (2009) Nat. Rev. Microbiol. 7, 411-423.
[12]  Wiegert et al., (2001) Mol. Microbiol. 41, 59-71.
[13]  Zellmeier, S., Schumann, W., Wiegert, T. (2006) Mol. Microbiol. 61, 1569-1582.


Janine Heinrich
* 1982

Stationen
  • 10/2001 – 04/2006
  • Studium der Biologie, Fachrichtung Molekular- und Zellbiologie, Universität Bayreuth
  • 04/2006
  • Diplom in Biologie - Thema: Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit Funktion in der Modulation der σW- Aktivität.
  • seit 06/2006
  • Promotion an der Universität Bayreuth / Lehrstuhl für Genetik - Thema: Analyse der regulierten intramembranen Proteolyse des RsiW anti-Sigmafaktors aus Bacillus subtilis
  • seit 06/2007
  • Forschungsstipendiatin im Elitenetzwerk Bayern

Veröffentlichungen
  • Heinrich, J. and Wiegert, T. (2006). YpdC determines site-1 degradation in regulated intramembrane proteolysis of the RsiW anti-sigma factor of Bacillus subtilis. Mol Microbiol 62, 566-579.
  • Heinrich, J., Lundén, T., Kontinen, V.P., and Wiegert, T. (2008). The Bacillus subtilis ABC transporter EcsAB influences intramembrane proteolysis through RasP. Microbiology 154, 1989-1997
  • Heinrich, J. and Wiegert, T. (2009) Regulated intramembrane proteolysis in the control of ECF sigma factors. Research in Microbiology. Accepted.
  • Heinrich, J. and Wiegert, T. (2009). Two proteolytic modules are involved in regulated intramembrane proteolysis of B. subtilis RsiW. Mol Microbiol. In revision.